Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе 03. 00. 04 биохимия 14. 00. 16 патологическая физиология

Главная страница
Контакты

    Главная страница



Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе 03. 00. 04 биохимия 14. 00. 16 патологическая физиология

Скачать 424.83 Kb.


страница2/3
Дата12.01.2017
Размер424.83 Kb.
ТипАвтореферат

Скачать 424.83 Kb.

1   2   3

Рис. 1. Содержание внутриклеточных АФК, количество аннексин-положительных и некротизированных клеток в культуре нейтрофильных лейкоцитов при инкубации с разными концентрациями перекиси водорода
Сходная ситуация отмечалась при сравнении количества аннексин-положительных клеток в экспериментальной и клинических группах, что указывает на близкий механизм активации апоптоза нейтрофилов, культивируемых в присутствии 5 мМ перекиси водорода in vitro, и нейтрофилов, полученных у больных с острым воспалением. Число апоптотически измененных клеток в культуре нейтрофилов, полученных у пациентов с внебольничной пневмонией (62,37(54,25–69,20)%) и у больных острым аппендицитом (57,40(51,37–62,37)%), достоверно превышало контрольную величину (р<0,05) и не отличалось от его значения при экспериментальном ОС (р>0,05). Количество клеток с пермеабилизированной мембраной в культуре нейтрофилов, полученных у больных внебольничной пневмонией (5,50(4,30–6,50) %), статистически превышало (p<0,05) контрольную величину; значения данного параметра в культуре нейтрофильных лейкоцитов, выделенных из крови у больных острым аппендицитом (4,20(3,80–5,70)%), оставалось в пределах контрольных величин (р>0,05).

В проведенном нами исследовании влияние АФК на развитие апоптоза нейтрофилов подтверждалось наличием положительной корреляции между увеличением внутриклеточного уровня АФК и возрастанием количества аннексин-положительных клеток в культурах нейтрофилов, полученных у здоровых доноров при индукции ОС 5 мМ Н2О2 (r=0,89, p<0,05), а также в клетках, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями (r=0,71, p<0,05).


2. Влияния оксида азота на апоптоз нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
Известно, что оксид азота является, с одной стороны, одним из компонентов окислительного стресса, с другой – важнейшим медиатором клеточного метаболизма [Зенков Н.К., и соавт., 2001 Tuteja N. et al., 2004]. Для установления роли NO в механизмах регуляции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе в параллельных экспериментах клетки культивировали в присутствии индуктора или ингибитора NO-синтазы.

Изучение концентрации конечных метаболитов NO в среде инкубации нейтрофилов показало, что под действием 5 мМ Н2О2 происходит статестически значимое увеличение продукции оксида азота по сравнению с интактной культурой (p<0,05), что в целом согласуется с данными литературы [Thomas S. R., 2002] (рис. 2). Оценка концентрации метаболитов оксида азота в культуре нейтрофилов, полученных у пациентов с острым воспалением, выявила увеличение значений исследованного показателя в 1,5 раза по сравнению с таковыми в интактной культуре клеток у здоровых доноров (р<0,05) и в 1,3 раза по сравнению со стресс-контролем (р<0,05) (рис. 2).

Было установлено, что при культивировании нейтрофилов в присутствии L-аргинина способствует повышению концентрации метаболитов NO достоверно повышается. Культивирование нейтрофильных лейкоцитов с L-NAME приводило к снижению концентрации метаболитов оксида азота при экспериментальном ОС до контрольных значений. При работе с нейтрофилами, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, воздействие ингибитора NO-синтазы приводило к снижению концентрации метаболитов NO до базового уровня, характерного для клеток при остром воспалении. Данный факт свидетельствует о запуске как ферментативного, так и неферментативного механизмов наработки оксида азота, нечувствительных к воздействию L-NAME, в условиях воспалительного процесса [Реутов В.П. и соавт., 1998; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2000; Beltran B. et al. 2000, 2002].

В результате проведенного исследования было установлено, что L-аргинин не влияет на содержание АФК в цитозоле нейтрофилов ни при ОС in vitro, ни у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями. Увеличение уровня АФК отмечалось лишь при добавлении ингибитора NO-синтазы в условиях экспериментального окислительного стресса (р<0,05).

При оценке количества апоптотически измененных клеток оказалось, что L-аргинин эффективно снижал число аннексин-положительных нейтрофилов в культурах с моделированием ОС in vitro до уровня, не отличавшегося от контрольных значений (р>0,05). Исследование чувствительности нейтрофилов крови, полученных у больных с острым воспалением, к воздействию индуктора синтеза оксида азота не позволило выявить изменений количества апоптозных клеток по сравнению с культурой нейтрофилов, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, не подвергавшейся воздействию L-аргинина (рис. 2).

Предположение о влиянии оксида азота на развитие апоптоза нейтрофилов подтверждается существованием обратной зависимости, выявленной при проведении корреляционного анализа, между концентрацией метаболитов NO в нейтрофилах и числом аннексин-положительных клеток в культурах нейтрофилов у здоровых доноров при индукции ОС 5 мМ Н2О2 (r =-0,83, p<0,05) и в клетках, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями (r =-0,59, p<0,05).

Воздействие L-NAME на нейтрофильные лейкоциты, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями, сопровождалось увеличением числа аннексин-положительных клеток в 1,2 раза по сравнению с базовым уровнем (р<0,05) (рис. 2).

Подводя итог, можно сделать вывод о протекторной роли NO в регуляции программированной гибели нейтрофилов в условиях окислительного стресса. Однако полученные результаты не позволяют однозначно ответить на вопрос, является ли оксид азота протекторным агентом непосредственно или стимулятором механизмов, защищающих клетку от повреждения. Установление молекулярных механизмов реализации апоптотической гибели в ответ на повышение или снижение концентрации оксида азота в клетке в условиях окислительного стресса является важной теоретической и практической задачей. Исследования в этом направлении позволят не только сделать выводы о влиянии NO на апоптоз нейтрофилов в условиях экспериментального окислительного стресса, но и предположить схожие механизмы участия оксида азота в развитии гибели нейтрофилов в очаге воспаления.


3. Молекулярные механизмы управления апоптоза нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
Для определения молекулярных мишеней воздействия оксида азота при реализации программированной гибели нейтрофилов нами поставлена задача оценки причинно-следственных связей каскадных реакций передачи внутриклеточных сигналов. Для исследования регуляторной роли оксида азота изучены изменения концентрации внутриклеточных мессенджеров (цГМФ, цАМФ, Ca2+) в нейтрофильных гранулоцитах при развитии окислительного стресса.
Исследование концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах у здоровых доноров, проведенное с помощью радиоиммунного метода, выявило, что данный показатель составл (114,13(101,96–120,55) нМ/106 кл) и (12,25(10,48–17,04) нМ/106 кл), соответственно. При количественной оценке содержания цАМФ и цГМФ в клетках, подвергшихся воздействию 5 мМ перекиси водорода, было установлено, что концентрация цАМФ возрастала в 1,2 раза (р<0,05), а концентрация цГМФ, напротив, снижалась в 3,0 раза (р<0,05), что приводило к существенному увеличению соотношения циклических нуклеотидов по сравнению с контрольными значениями в 3,4 раза.

Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах, полученных у больных с острым воспалением, показало, что значения данного параметра были достоверно ниже аналогичных не только в интактной культуре нейтрофильных гранулоцитов, но и в группе стресс-контроля – в 1,3 и 1,5 раза, соответственно (р<0,05). Содержание цГМФ также было ниже соответствующего параметра в контроле (р<0,05), достигая при этом уровня, близкого к таковому в случае воздействия на клетки in vitro 5 мМ перекиси водорода (рис. 2). Выраженное снижение концентрации цГМФ в нейтрофилах, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, обеспечивало увеличение (в 2 раза) отношения концентраций цАМФ/цГМФ в клетке.

Увеличение отношения содержания цАМФ и цГМФ при активации программированной клеточной гибели нейтрофилов, по всей видимости, носит защитно-приспособительный характер. Данные о влиянии цАМФ на апоптоз относительно малочисленны и свидетельствуют о тканеспецифическом характере регуляции программированной клеточной гибели системой циклических нуклеотидов [Chang H.S. et al., 2000; Kato T. et al., 2006].

Возможная биологическая роль повышения содержания цАМФ в нейтрофилах, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, связана со способностью данного циклического нуклеотида подавлять фагоцитоз нейтрофилов макрофагами в очаге воспаления [Rossi A.G. et al., 1998].

Культивирование нейтрофилов с 500 мкМ L-аргинином в условиях окислительного стресса in vitro приводило к достоверному снижению внутриклеточного содержания цАМФ (р<0,05) и увеличению концентрации цГМФ в нейтрофилах до контрольных значений (р>0,05). Трехкратное увеличение содержания цГМФ в нейтрофильных гранулоцитах относительно базового уровня приводило к снижению отношения цАМФ/цГМФ до значений контрольной группы. Воздействие индуктора синтеза оксида азота на нейтрофилы, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями, не приводило к изменению концентрации цАМФ относительно собственного базового уровня (р>0,05), но сопровождалось увеличением содержания цГМФ в клетках в 2,3 раза (р<0,05), что также приводило к снижению отношения цАМФ/цГМФ. Повышение содержания цГМФ, на наш взгляд, может быть напрямую связано со стимуляцией растворимой гуанилатциклазы оксидом азота [Hanafy K.A., 2001; Bian K., 2006].

Приведенная выше интерпретация результатов собственных исследований и анализ данных, полученных другими авторами, позволили высказать предположение, что оксид азота за счет повышения внутриклеточного содержания цГМФ снижает соотношение циклических нуклеотидов до близких к контрольным значениям, тем самым, стабилизируя метаболизм нейтрофилов и продлевая жизнь клетки.

Культивирование нейтрофилов с 500 мкМ L-NAME в условиях окислительного стресса in vitro приводило к достоверному снижению концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах в (1,5 и 3,0 раза, соответственно) (р<0,05) (рис. 2), что, однако, сопровождалось увеличением отношения цАМФ/цГМФ в данных клетках. Воздействие ингибитора NO-синтазы на нейтрофильные гранулоциты, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями, сопровождалось снижением содержания цАМФ и цГМФ (в 1,4 и 1,6 раза относительно базового уровня, соответственно) (р<0,05) (рис. 2) и увеличением отношения концентраций циклических нуклеотидов.

Увеличение отношения концентраций цАМФ/цГМФ, отмеченное нами в нейтрофильных лейкоцитах, культивированных в присутствии 5 мМ Н2О2 перекиси водорода и ингибитора NO-синтазы, может быть связано с токсическим влиянием Н2О2 на аденилатциклазу и гуанилатциклазу. Токсическое влияние перекиси водорода во многом усиливается при отсутствии стабилизирующего влияния оксида азота на электронно-транспортную цепь митохондрий [Beltran B. et al. 2000, 2002]. Введение L-NAME в культуральную среду приводило к росту концентрации внутриклеточных АФК и усугубло развитие ОС.

Изменение баланса циклических нуклеотидов, отмеченное нами при культивировании нейтрофилов, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, с селективным ингибитором NO-синтазы, происходило на фоне увеличения числа нейтрофилов, вступивших на путь апоптоза. Вероятно, что повышение отношения внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов при развитии программированной гибели нейтрофилов носит транзиторный характер, связанный с нормализацией клеточного метаболизма и предотвращением клеточной гибели.

Как показали результаты исследования, направленного на определение концентрации кальция в цитоплазме нейтрофилов крови, значения данного показателя в интактных клетках у здоровых доноров составили (0,220(0,114–0,234)усл.ед.). Добавление в культуральную среду 5 мМ перекиси водорода приводило к двукратному повышению содержания Ca2+в нейтрофилах крови по сравнению с соответствующим параметром в контроле (р<0,05) (рис.2).




а)

б)

в)

г)

д)

е)


1 – интакные нейтрофилы

2 – нейтрофилы, культивированные с 5 мМ Н2О2

3 - нейтрофилы, культивированные с 5 мМ Н2О2 и L-аргинином

4 - нейтрофилы, культивированные с 5 мМ Н2О2 и L-NAME

5 – нейтрофилы, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями

6 – нейтрофилы, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями и культивированные с L-аргинином

7 – нейтрофилы, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями и культивированные с L-NAME



Каталог: referat
referat -> Пётр Великий в творчестве А. С. Пушкина
referat -> Реферат По Физике Механика от Аристотеля до Ньютона 2000-01 уч год. Основная часть
referat -> Реферат Сравнение взглядов на модель государства у Платона и Аристотеля
referat -> Темы рефератов по патофизиологии
referat -> Реферат архитектура многофункциональных бизнес-центров Санкт-Петербург 2013 Введение
referat -> 3 Основные виды архитектур эвм, микро-эвм и пк. Эвм и мультимедиа. 4 Состав устройств, структура и порядок функционирования Эвм и вычислительной системы. Объединение ЭВМ в сеть»
1   2   3

  • 2. Влияния оксида азота на апоптоз нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
  • 3. Молекулярные механизмы управления апоптоза нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении