Рисунок.4. Реакция взаимодействия гидроксил-радикала с люминолом

Главная страница
Контакты

    Главная страница



Рисунок.4. Реакция взаимодействия гидроксил-радикала с люминолом



страница4/11
Дата12.01.2017
Размер1.94 Mb.
ТипРеферат


1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11
Рисунок.4. Реакция взаимодействия гидроксил-радикала с люминолом.
В результате этой реакции происходит испускание кванта света (в данном случае это – сверхслабое свечение, которое мы можем зафиксировать с помощью приборов) (Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях //Биология//Соровский образовательный журнал, том 7 №1, 2001, стр.16-23, рисунок 4 взят из этого же источника).

Перед описанием экспериментов и опытов сначала коротко об обозначениях концентраций и единиц измерений. Для обозначения концентраций в некоторых случаях мы использовали абсолютную концентрацию образца в данном растворе (она измерялась в молях или миллимолях, но для обозначения концентрации SDS часто будет использоваться обозначение концентрации, относительно цитохрома ц (cyt c). Эти значения показывают, во сколько раз концентрация SDS в образце при данном опыте отличается от концентрации цитохрома ц. Например, обозначение 1 к 1, или относительная концентрация равна 1 означает, что если концентрация цитохрома ц в растворе составляет 10 мМ, то концентрация SDS тоже составляет 10 мМ, а обозначение 1 к 100 или относительная концентрация 100 показывает, что концентрация SDS в 100 раз больше, чем концентрация цитохрома ц.



Обозначением у.е. (условные единицы) обычно обозначают интенсивности свечения по сравнению с некоторым нулём, т.е. за 0 при измерении хемилюминесценции принято значение, при котором на фотоэлектронный умножитель не падает свет, при измерении спектра поглощения за 0 принимается спектр поглощения фосфатного буфера (который практически прозрачен).

При вычислении светосуммы мы пользовались формулой , т.е. вычисляли светосумму, как площадь по кривой, полученной в результате измерения. Для вычисления использовали численный метод разбиения на прямоугольники.

Также для обозначения содиумдодецилсульфата часто будет применяться обозначение SDS, для обозначения цитохрома ц – Cyt C.

Для проверки того, что пероксидазная реакция в данном случае есть, мы использовали метод измерения хемилюминесценции. Принцип метода заключается в том, что мы измеряем сверхслабое свечение, которое имеет место быть при данной реакции. Раствор мы помещаем в кювету, и свет, выходя из неё, попадает на фотоэлектронный умножитель, который соединён либо с самописцем, либо с компьютером.

Нам необходимо было, во первых, доказать, что пероксидазная активность имеет место, а во вторых, найти, в каких концентрациях и в каком соотношении брать цитохром и содиумдодецилсульфат, чтобы хемилюминесценция была наиболее ярко выражена, и при этом, чтобы использовать, по возможности, меньшее количество SDS и цитохрома . Для этого мы делали опыт при соотношении концентраций цитохрома ц и содиумдодецилсульфата от 1 к 0 до 1 к 4000. Для проведения экспериментов мы готовили 1 мл раствора, который во всех опытах содержал 10 мкл 1 мМ цитохрома ц, 50 мкл 2 мМ перекиси водорода и 100 мкл люминола. Остальные 840 мкл составляли буферный раствор и SDS, содержание которых в каждом опыте различалось. 10 мкл 1 мМ цитохрома получились разведёнными в 100 раз, и его абсолютная концентрация составила 0,1 мМ, или100 мкМ. Результаты опытов показаны на диаграмме 1. По ней видно, что с увеличением содержания SDS интенсивность хемилюминесценции увеличивается:





Диаграмма 1:

На графике 1 изображены результаты измерений хемилюминесценции раствора цитохрома ц и содиумдодецилсульфата (SDS) в разных концентрационных соотношениях. p<0.05

По оси абсцисс отложено время измерения в секундах, по оси ординат – интенсивность хемилюминесценции. Кривыми показана кинетика хемилюминесценции. На правой стороне диаграммы расположена колонка, с помощью которой по цвету можно определить, какое концентрационное соотношение имеет та или иная кривая.

По данным Диаграммы 1 можно определить зависимость светосуммы от соотношения концентрация цитохрома и содиумдодецилсульфата. Данные показаны на диаграмме 2 и в таблице 1:




Соотношение концентраций SDS к цитохрому С

Светосумма

0

1.573933

50

0.243033

100

0.246592

200

1.242092

400

8.437692

800

11.86132

1000

8.9853

2000

10.68142

4000

12.68086

Таблица 1.
По этим данным была построена диаграмма 2, с помощью которой можно увидеть наиболее эффективное соотношение концентраций для цитохрома ц и содиумдодецилсульфата.



Диаграмма 2. Зависимость светосуммы от соотношения концентрации цитохрома и содиумдодецилсульфата. p<0.05 .

По оси абсцисс отложено соотношения концентраций цитохрома и содиумдодецилсульфата, по оси ординат – светосумма в условных единицах. Красной стрелкой показано эффективное соотношение концентраций, которое мы будем использовать в дальнейших опытах.
В обоих случаях мы измеряли хемилюминесценцию 1 мл раствора, который всегода содержал 100 мкл 50 мМ раствора люминола и 50 мкл 2мМ раствора пероскида водорода, так как эти концентрации являются наиболее приемлемыми (А.Н. Осипов, Г.О. Степанов, Ю.А. Владимиров, А.В.Козлов, В.Е.Каган. Регуляция пероксидазной активности цитохрома ц с помощью оксида азота и лазерного излучения//Биохимия, 2006, том 71, вып. 10, стр.1392-1398).

Данные опыты показывают, что цитохром ц обладает пероксидазной активностью, и что при добавлении содиумдодецилсульфата пероксидазная активность увеличивается, но при соотношениях молярных концентраций 600 SDS на 1 цитохром кривая выходит на плато, т.е. с этого момента увеличении относительной концентрации SDS к цитохрому увеличивает пероксидазную активность намного меньше, чем до значения 1 к 600.



На следующей диаграмме приведены опыты с тетраолеоилкардиолипином (TOCL) Это липид, который содержится в митохондриях клеток, и теоретически может непосредственно влиять на цитохром С. Видно, что концентрации, при которых пероксидазная активность цитохрома С становится высокой, гораздо ниже, цем концентрации SDS-а. Это связано с тем, что SDS, являясь детергентом, поверхностно взаимодействует с молекулой цитохрома С, в то время, как TOCL двумя из своих гидрофобных хвостов может проникать к центру молекулы цитохрома, и влиять на него изнутри.


В следующем этапе исследования нам надо подробнее узнать механизмы воздействия SDS на Cyt C, а также лучше понять, что происходит с самой белковой молекулой. Для этого мы будем измерять спектр поглощения цитохрома ц в присутствии SDS в различных концентрациях. При добавлении в раствор цитохрома ц раствора SDS, у цитохрома ц начинает изменяться третичная структура белка, т.е. изменяется конформация, и при этом происходит отдаление метионина 80 от гемового центра, в результате чего оптическая плотность при длине волны около 695 нм уменьшается (Silke Oellerich, Hainer Wackerbarth, Peter Hildebrandt. Conformational equilibria and dynamics of cytochrome C induced by binding of sodium dodecyl sulfate monomers and micelles//Eur Biophys Journal (2003) 32. pages 599-613).



Принцип метода спектроскопии заключается в том, что многие вещества поглощают свет определённых длин волн. Самый простой пример этого – это жидкость какого-либо цвета. Мы можем видеть цвет жидкости, потому, что жидкость поглощает свет в том диапазоне длин волн, каким цветом мы видим жидкость. Длина волны поглощения зависит от различных квантовомеханических параметров. Принцип спектрофотомерии основан именно на этом явлении. Эксперимент проводится таким образом: в специальный прибор (спектрофотометр) ставят кювету с исследуемым раствором, за нем через кювету пропускают цвет с разными длинами волн, и в том участке длин волн, где будет происходить поглощение, будет наблюдаться высокая оптическая плотность, интенсивность света, попавшего на детектор, на который попадает вышедший из кюветы свет, будет меньше, чем интенсивность света, который вышел из источника света. Этот процесс описывается с помощью закона Бугера-Ламберта-Бера, который математически выражается так:

Где I – это интенсивность света, падающего на кювету (размерность Дж/(с*м2)), I0 – интенсивность света, вышедшего из кюветы. ℮ - экспонента (приблизительно равна 2,7), ε – молярный коэффициент поглощения (фактически, при спектрофотометрических опытах мы будем оценивать именно его), с – молярная концентрация вещества, l – ширина кюветы (или, если точнее, длина пути, пройденная светом). У цитохрома ц есть три пика в спектре поглощения в видимой области длин волн: это полоса Саре – 417 нм, которая обусловлена поглощением самого гемового комплекса. Ещё мы видим увеличение оптической плотности в районе 550 нм, а при большом разрешении спектра можно увидеть пик в районе 695 нм.



На рисунке 5 представлен принцип спектрофотометрического исследования. Большинство соединений и молекул имеют свой спектр поглощения, и при некоторых изменениях иногда он может немного изменяться (в нашем случае это изменение конформации белковой молекулы цитохрома ц). В нашем случае это происходит при взаимодействии SDS, в частности, в нашем случае это влияет на изменение величины оптической плотности в определённых участках спектра.


Каталог: fileadmin -> rsmu -> img -> mbf -> cmfrb -> documents -> referati
referati -> Реферат: острая и хроническая почечная недостаточность. Механизмы повреждения почек. Подходы к лечению
referati -> Реферат по фармакологии студентки 471 гр. Воробьёвой Ольги. 2008г. Содержание: Общая информация
mbf -> Комплексные числа
mbf -> Рабочая программа учебной дисциплины общая патология направление подготовки (специальность) 060601 Медицинская биохимия
mbf -> Рабочая программа учебной дисциплины «Физиология с основами анатомии»
mbf -> Рабочая программа учебной дисциплины нормальная физиология наименование учебной дисциплины
mbf -> Программа спецкурса по выбору название курса Медицинские нанобиотехнологии Специальность Медицинская биохимия
mbf -> Рабочая программа учебной дисциплины общая патология направление подготовки (специальность) 060602 Медицинская биофизика
mbf -> Министерство здравоохранения и социального развития
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

  • Диаграмма 1: На графике 1 изображены результаты измерений хемилюминесценции раствора цитохрома ц и содиумдодецилсульфата ( SDS
  • Таблица 1. По этим данным была построена диаграмма 2
  • Диаграмма 2. Зависимость светосуммы от соотношения концентрации цитохрома и содиумдодецилсульфата. p