Эффекторная фаза апоптоза и разрушение клеточных белков: каспазы

Главная страница
Контакты

    Главная страница



Эффекторная фаза апоптоза и разрушение клеточных белков: каспазы



страница6/15
Дата12.01.2017
Размер2.31 Mb.
ТипОтчет


1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   15

1.4.1.5 Эффекторная фаза апоптоза и разрушение клеточных белков: каспазы

У млекопитающих идентифицировано как минимум 14 CED-3 аналогов, большинство из которых участвует в процессе апоптоза. Эти аналоги, называемые каспазы 1-14 (цистеин-аспартат-специфичные протеазы), транслируются в неактивных формах, которые далее активируются путем частичного протеолиза. Механизмы активации каспаз подразделяют эти ферменты на 2 различные категории. Первая, включающая каспазы-2, -8, -9, -10, - инициаторные каспазы [Барышников В.В. 2002; Северин С.Е. 1998]. Эти ферменты обладают уникальными структурными доменами, облегчающими аутокатализ, процесс, необходимый для объединения белков в единый комплекс. Например, каспазы-8 и –10, каждая, содержат N-концевой эффекторный домен, позволяющий этим каспазам взаимодействовать с рецепторами клеточной гибели (Fas, TNFRI) с помощью адаптерного белка FADD [Cohen G.M. 1997]. Инициаторные каспазы-2 и –9, каждая, содержат CARD. Каспаза-9 взаимодействует с Apaf-1 в процессе апоптоза, что опосредуется высвобождением цитохрома с из митохондрий [Bantel H. 2001; Basanez G. 2001]. Эти взаимодействия происходят за счет присутствия CARD как в каспазе-9, так и в Apaf-1. Активация каспазы-12, другой инициаторной каспазы, как недавно было показано, происходит путем, не зависимым от митохондрии и Apaf-1, в ответ на повреждение на уровне эндоплазматического ретикулума. После процессинга активные инициаторные каспазы активируют вторую линию ферментов своего семейства – инициаторные каспазы (каспаза-3, -6 и –7) [Bantel H. 2001; Basanez G. 2001; Bodmer J. 2000; Cohen G.M. 1997]. Активные эффекторные каспазы селективно гидролизуют широкий спектр полипептидных целей, включая протеин-киназы, белки сигнальной трансдукции, компоненты цитоскелета, ингибиторы дезоксирибонуклеаз. Т.о., активация каскада эффекторных каспаз не только делает клетку неспособной выполнять свои функции и поддерживать гомеостаз, но и облегчает разрушение и упаковку клеточных структур в небольшие тельца, ограниченные мембраной, готовые к фагоцитозу – конечному этапу апоптоза. Zhаng et al [2000, 2001] использовали модель клеточных рецепторов гибели in vivo, чтобы продемонстрировать, что удаление одной из каспаз (-9 или –3) путем удаления ее гена откладывает гибель гепатоцитов. Иммуноблот-анализ различных представителей семейства каспаз выявил, что каспазы-2, -6 и –7 активировались в экстрактах, приготовленных из клеток, не имеющих каспаз –9 или –3. Из этого исследования был сделан вывод о том, что митохондриальный путь активации каспаз (формирование апоптосомы и активация каспазы-9) может вовлекать в себя одновременную активацию различных альтернативных инициаторных и эффекторных каспаз, вплоть до количества, достаточного для эффективного уничтожения и удаления клеточных структур путем апоптоза.



1.4.2 Протеинкиназы в механизме апоптоза




1.4.2.1 Митоген-активируемая протеинкиназа

Связь суперсемейства митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК) с апоптозом отмечается в большом количестве публикаций, причем отмечено как активирование, так и блокирование клеточной гибели. Эта группа белков состоит из трех семейств: внеклеточные сигнальные киназы (антиапоптотические) – ERK, проапоптотические или стресс-активируемые р38 МАРК и проапоптотические или стресс-активируемые JNK [Cohen G.M. 1997]. Активация каждого семейства происходит в каскаде фосфорилирования, что в свою очередь приводит к посттрансляционным изменениям молекул-мишеней, изменениям экспрессии генов или обоим изменениям. В настоящей главе внимание сфокусировано на семействе JNK и его роли в качестве проксимального медиатора апоптоза. Однако необходимо отметить, что роль JNK в активации апоптоза зависит от типа клетки и вида стимула. Было предположено, что влияние активации JNK на апоптоз зависит от активности других сигнальных путей, например ERK или NFkB-опосредованных, что позволяет предположить, что активация JNK облегчает, но не обязательно инициирует процесс апоптоза[Cohen G.M. 1997].



На сегодняшний день открыто 3 гена, кодирующих 10 вариантов мРНК для JNK, – такая избыточность затрудняет изолированное изучение влияния JNK только на апоптоз. Кроме того, киназы, фосфорилирующие и таким образом активирующие JNK, тоже весьма разнообразны. Каспаза катализирует расщепление регулирующих JNK-путь киназ, что усиливает апоптоз. Ассоциация адаптерного протеина Daxx с активированным Fas также инициирует активацию JNK. Однако значение этих событий для апоптоза, т.е. требовала или нет активация апоптоза в этой модели участия JNK – достоверно не выяснено. Эксперименты на моделях с отсутствием отдельных генов JNK не смогли показать дефектов в процессе апоптоза. Однако мыши с отсутствием и JNK1 и JNK2 погибали в эмбриогенезе из-за нарушений нейронального апоптоза. Эмбриональные мышиные фибробласты (MEF) с отсутствием JNK1 и JNK2 резистентны к стресс-индуцируемому, но не опосредованному через клеточные рецепторы гибели апоптозу. Было показано, что такие MEF не способны высвобождать цитохром с из дестабилизированных митохондрий – необходимый шаг в стресс-индуцируемом апоптозе, который можно обойти при 1 типе апоптоза, индуцированном рецепторами клеточной гибели [Werner A.B. 2000, 2001].

1.4.2.2 Фосфатдилинозитол 3’-киназа (PI3-K) и Akt



Клеточный сигнальный механизм выживания, связанный либо с рецепторами ростовых факторов (например рецептор тирозин-киназы), либо с другими антиапоптотическими сигнальными механизмами (протеинкиназа А, NFkB) [Yamamoto K. 1999]. Большое число исследований подтвердило, что PI3-K активируется путем экспрессии на цитоплазматической поверхности плазматической мембраны, что ведет к лигандной активации рецепторов ростовых факторов, или путем прямого взаимодействия с Ras протоонкогеном. Активированная PI3-K катализирует образование 3’-фосфорилированных фосфоинозитидов из фосфолипидов клеточной мембраны. Эти липидные молекулы затем связываются и таким образом активируют серин\треонин-киназу, 3’-фосфоинозитид-зависимую киназу-1 (PDK-1), которая является основным ферментом, способным активировать разнообразные киназы, включая Ak[].t. В физиологических условиях активированная ростовыми факторами Akt служит для фосфорилирования белков, поддерживающих основные функции клеток, такие как транспорт и окисление глюкозы. В частности, активация рецептора инсулин-подобного фактора роста-1 (ИПФР-1) его лигандом индуцирует Akt-опосредованное фосфорилирование киназы-3 гликоген-синтетазы. Фосфорилирование переносчика глюкозы (Glut-4) Akt приводит к eго транслокации на клеточную поверхность и утилизации глюкозы [Yamamoto K. 1999]. Нарушения Akt-сигнального пути обычно происходят при нарушении гомеостаза и вызывают апоптоз путем блокирования жизненно-необходимых обменных процессов (например легочного дыхания) и активирования компонентов механизма апоптоза [Adrain C. 2001]. Стресс-индуцированный механизм связан с повреждением клетки или потерей факторов роста – он может ослабить или полностью блокировать Akt-сигнальный механизм. Было продемонстрировано, что различные регуляторы апоптоза зависят от активности Akt на уровнях транскрипции или посттрансляционных изменений. В частности, представители семейства факторов транскрипции Forkhead после фосфорилирования Akt остаются связанными с другими цитозольными белками (14-3-3 протеины) [Adrain C. 2001]. Однако в отсутствии Akt-опосредованного фосфорилирования факторы транскрипции Forkhead могут транслоцироваться в ядро и повышать экспрессию проапоптотических регуляторных генов, таких как лиганд Fas. Другой пример – активность проапоптотического ВН3-протеина, Bad, регулируется его статусом фосфорилирования [Adrain C. 2001; Antonsson В. 2001; Basaflez G. 2001]. В клетках, поддерживаемых достаточным уровнем факторов роста, активация Akt ведет к зависимой от фосфорилирования секвестрации Bad 14-3-3 протеинами. Однако потеря Ask-сигнального пути или повышение фосфатазной активности приводит к высвобождению Bad, делая его свободным для взаимодействия с другими представителями семейства Bcl-2, облегчающего апоптоз. Akt также напрямую взаимодействует с прокаспазой-9. Точный механизм, путем которого каспаза-9 инактивируется из-за фосфорилирования Akt, неизвестен, но предполагается, что каталитическая активность каспазы-9 блокируется напрямую[Basaflez G. 2001]. Участок фосфорилирования Akt (RXRXXS/T) идентифицирован в других белках-регуляторах апоптоза на каждом уровне апоптотического каскада (каспаза-8, Bcl-2, Apaf-1, IAP, каспаза-7).

1.4.3 Белки – регуляторы апоптоза

Все факторы, усиливающие или ослабляющие апоптоз, могут действовать прямо на механизм гибели клетки, опосредованно, путем влияния на регуляцию транскрипции. В некоторых случаях влияние этих факторов на апоптоз является решающим (например, при глюкокортикоид-зависимом апоптозе тимоцитов), а в других не имеет особой важности (например, при Fas- и TNF-зависимом апоптозе). В процессе регуляции принимает участие большое количество веществ. Наиболее изученными из них являются вещества из семейства bcl-2 [Adrain C. 2001; Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999].



1.4.3.1 Представители семейства Bcl-2

Митохондрии являются центром клетки, принимающим решение о запуске механизма ее гибели. Мембрана митохондрий разрывается, что приводит к образованию реактивных форм кислорода и высвобождению апоптогенных факторов, служащих сигналом для активации финальной (эффекторной) стадии апоптоза. Точные механизмы, за счет которых повышается проницаемость мембраны митохондрий, до конца не выяснены. Предложено несколько моделей. Большинство из них учитывают действие семейства регуляторных белков Bcl-2, которые самостоятельно или с помощью других белков митохондрий (переносчик аденилового нуклеотида ANT, потенциал-зависимый анионный канал VDAC) нарушают митохондриальный гомеостаз.

Идентифицированы аналоги Bcl-2 млекопитающих, эти белки являются ключевыми регуляторами апоптоза. Они состоят из двух антагонистических групп: антиапоптотические белки (Bcl-2, Bcl-x, Bcl-w, Bcl-B, Mcl-1, A1/Bfl-1) и проапоптотические[Adrain C. 2001; Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999]. Последняя группа подразделяется в зависимости от числа Bcl-2-гомологичных (ВН) доменов. Те, что содержат от двух до четырех ВН-доменов – т.н. мультидоменные представители семейства (Bax, Bak, Mtd/Bok, Boo/Diva, Bcl-rambo, Bcl-x-short) – действуют иначе, чем те, что содержат только ВН3-домен (Bad, Bid, Bik/NBK, Bim, Bmf-1, Hrk/DP5, Map-1, Nix, Nip3, Noxa, PUMA).

Раньше считали, что Bcl-2 и подобные белки работают как реостат, и баланс между про- и антиапоптотическими белками определяет судьбу клетки [Almawi W.Y. 2004; Aschoff A.P. 2001]. Однако сегодня известно, что регуляция апоптоза представителями семейства Bcl-2 более сложна, помимо механизма реостата включает в себя стимул-специфическую модификацию ВН3-белками. Во многих случаях ВН3-белки служат внутриклеточными сенсорами, которые могут активироваться либо на этапе транскрипции (Nip3, Nix, PUMA, Noxa, Hrk), либо после транскрипции (Bad, Bid, Bik, Blk, Map-1) через множество механизмов сигнальной трансдукции [Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999]. После активации эти белки вступают во взаимодействия со своими мультидоменными собратьями. В зависимости от вида ВН3-белка, эти взаимодействия могут либо облегчить введение проапоптотических мультидоменных белков семейства Bcl-2 через митохондриальную мембрану, нарушая ее целостность и потенциал покоя, необходимый для окислительного фосфорилирования, либо нивелировать действие антиапоптотических белков семейства Bcl-2 [Almawi W.Y. 2004; Aschoff A.P. 2001]. Однако сегодня известно, что ВН3-белки способны взаимодействовать с мультидоменными представителями семейства Bcl-2 без последующих посттрансляционных изменений.



Bcl-2 ген впервые был описан как ген, который транслоцируется в клетках фолликулярной лимфомы и ингибирует апоптоз.. Гомологичные гены были также обнаружены в некоторых вирусах. Все вещества, относящиеся к данному классу делятся на активаторы и ингибиторы апоптоза. К ингибиторам относятся: bcl-2, bcl-xL, Mcl-1, bcl-w, аденовирусный E1B 19K, Эпштейн-Барр-вирусный BHRF1 [Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999]. К активаторам относятся bax, bak, Nbk/Bik1, Bad, bcl-xS [Bardelli A. 2000]. Члены этого семейства взаимодействуют друг с другом. Одним из уровней регуляции апоптоза является взаимодействие белок-белок. Белки семейства bcl-2 формируют как гомо- так и гетеродимеры. Например, bcl-2-ингибиторы могут образовать димеры bcl-2-активаторами. Таким образом, жизнеспособность клеток зависит от соотношения активаторов и ингибиторов апоптоза. Например, bcl-2 взаимодействует с bax; при преобладании первого жизнеспособность клетки повышается, при избытке второго – уменьшается. К тому же белки семейства bcl-2 могут взаимодействовать с белками, не относящимися к этой системе. Например, bcl-2 может соединятся с R-ras, который активирует апоптоз. Другой белок, Bag-1, усиливает способность bcl-2 ингибировать апоптоз [Bardelli A. 2000]. В настоящее время принято считать, что гены, участвующие в регуляции роста и развития опухолей (онкогены и гены-супрессоры опухолей), играют регулирующую роль в индукции апоптоза. К ним относятся: bcl-2 онкоген, который ингибирует апоптоз, вызванный гормонами и цитокинами, что приводит к повышению жизнеспособности клетки; Белок bax (также из семейства bcl-2) формирует димеры bax-bax, которые усиливают действие активаторов апоптоза [Basaflez G. 1999; Bardelli A. 2000]. Отношение bcl-2 и bax определяет чувствительность клеток к апоптотическим факторам и является «молекулярным переключателем», который определяет, будет ли происходить рост или атрофия ткани. За исключением гена, кодирующего 2’-5’ олигоаденилат-синтетазу, экспрессия которого индуцируется интерфероном-бета, большинство ВН3-генов экспрессируются в результате повреждения клетки, вызванного гипоксией, повреждением ДНК или отсутствием определенных цитокинов. После активации амфифильный альфа-участок многих ВН3-белков взаимодействует с гидрофобной частью антиапоптотических белков семейства Bcl-2, вызывая их реолигомеризацию и отщепление от проапоптотических мультидоменных представителей семейства [Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999]. В этом случае ВН3-белки служат как внутриклеточные лиганды, связывающиеся и блокирующие антиапоптотические Bcl-2-подобные белки, что позволяет проапоптотическим мультидоменным представителям семейства, таким как Bax и Bak, дестабилизировать митохондрии и индуцировать апоптоз.


1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   15

  • 1.4.2 Протеинкиназы в механизме апоптоза
  • 1.4.2.2 Фосфатдилинозитол 3’-киназа (PI3-K) и Akt
  • 1.4.3 Белки – регуляторы апоптоза
  • 1.4.3.1 Представители семейства Bcl-2