Клинико-эпидемиологическая и лабораторная характеристика обследованных групп больных герпетической инфекцией (вирус простого герпеса -1,2 типа и цитомегаловирусная инфекция)

Главная страница
Контакты

    Главная страница



Клинико-эпидемиологическая и лабораторная характеристика обследованных групп больных герпетической инфекцией (вирус простого герпеса -1,2 типа и цитомегаловирусная инфекция)



страница10/15
Дата12.01.2017
Размер2.31 Mb.
ТипОтчет


1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   15

4.1.2 Клинико-эпидемиологическая и лабораторная характеристика обследованных групп больных герпетической инфекцией (вирус простого герпеса -1,2 типа и цитомегаловирусная инфекция)

Под наблюдением находилось 70 пациентов с хронической рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекцией (ВПГ-1,2). Критериями выбора пациентов для обследования являлись:

1) наличие различной частоты рецидивов генитального герпеса – от 2 до 12 и более раз в год;

2) продолжительность генитальной герпес-вирусной инфекции более одного года;

3) обследование в фазе обострения процесса или в периоде продромы, не более 48 часов от момента появления высыпаний;

4) отсутствие приема иммуномодулирующей терапии в течение последних 3 месяцев.

Диагноз ВПГ-1,2 верифицирован на основании клинической картины и данных лабораторного обследования, согласно рекомендациям 5-го международного форума (IHMF-1997) по диагностике генитального герпеса. По тяжести клинического течения ВПГ-1,2 инфекции легкая форма (1-2 рецидива в год) диагностирована у 10 пациентов (22,5 %) исследуемой группы, средняя (3-5 рецидива в год) - у 40 (70,83 %), тяжелая (6-12 и более рецидивов в год) - у 20(6,67 %) (таблица 14).

Клиническое обследование включало: анамнез жизни и заболевания, выявление сопутствующей патологии, аллергологический анамнез, а также регулярный осмотр мест поражения. При осмотре выяснялись жалобы пациента (зуд, жжение, общее состояние, температура, миалгия и др.), оценивалось состояние кожных покровов и слизистых (наличие везикулезных элементов, изъязвлений, эпителизации, отечности, гиперемии). Длительность генитальной герпес-вирусной инфекции у всех больных, включенных в исследование, составила в среднем 4,0±2,5 года. У 7,5% пациентов длительность заболевания не превышала 1,5 года, около 40% пациентов страдали заболеванием от 1,5 до 3-х лет, у 21,6% – генитальный герпес наблюдался от 3 до 5 лет, у 19,4% – от 5 до 8 лет, а 12,5% пациентов – более 8 лет.


Таблица 14 - Характеристика по полу и возрасту пациентов с герпетической инфекцией.

Группа

Количество рецидивов в год

Количество пациентов

Возраст


Пол


М

Ж

ВПГ-1,2

1


1-2

10

23-49

7

14

ВПГ-1,2

2


3-5

40

20-48

15

27

ВПГ-1,2

3


6 и более

20

24-48

17

30

ЦМВИ

-

40

22-42

11

29

По локализации у 50,7% пациентов высыпания возникали только в области гениталий, у 15,3% женщин и 21% мужчин наблюдалось экстрагенитальное поражение с очагами в области ягодиц, параанальной, лобковой области и внутренней поверхности бедер. Смешанное поражение (генитальная и экстрагенитальная локализация) выявлено у 34,0% женщин и 12% мужчин. Провоцирующими рецидивы факторами являлись взаимосвязь с менструальным циклом у женщин, стресс, переутомление, переохлаждение.

Анализ ранее проводимой терапии у обследуемых пациентов показал, что около 38% пациентов использовали только местную терапию (мазь с ацикловиром, растворы антисептиков). Около 50% пациентов использовали ациклические нуклеозиды, в 55% раннее проводилась комплексная терапия с подключением ациклических нуклеозидов и иммуномодуляторов (препараты интерферонов, индукторы интерферонов).

Также наблюдалось 40 человек с диагностированной цитомегаловирусной (ЦМВИ) инфекцией, из них 29 женщин и 11 мужчин. Цитомегаловирусная инфекция лабораторно была подтверждена с помощью РИФ у 19% больных, ПЦР — у 65% пациентов, методом иммуноблотинга антитела класса М к специфическим и высокоспецифическим белкам выявлены в 18% случаях, антитела класса G — в 34% случаях, с помощью ИФА антитела класса М выявлены у 10 (25%) человек. Средний титр антител класса IgM составил 1/275, минимальный — 1/100, максимальный — 1/800). Антитела класса IgG выявлены в 24 (60%) случаях (средний титр антител составил 1/3586, минимальный — 1/100, максимальный — 1/12800). ЦМВ инфекция в основном была выявлена при клинико-лабораторном обследовании при выявлении причин бесплодия (25%) и привычного невынашивания беременности (20%), 5% пациентов имели жалобы на частые рецидивирующие респираторные инфекции (от 4 до 8 раз в год).

Помимо пациентов с герпетической инфекцией под наблюдением находились больные с папилломавирусной инфекцией (ВПЧ) (таблица 15).
Таблица 15 - Характеристика по полу и возрасту пациентов с ВПЧ инфекцией.


Группа пациентов

Количество пациентов

Пол


Возраст, лет


М

Ж

С ВПЧ высокого онкогенного риска

54

5

49

19-42

С ВПЧ низкого онкогенного риска

42

11

29

21-44

Всего

96

16

78

-

У всех пациентов ВПЧ-инфекция подтверждалась ПЦР-анализом. Цитологические изменения при кольпоскопии у женщин с ВПЧ высокого онкогенного риска (койлоцитарная атипия, наличие в мазках двухъядерных и многоядерных клеток, амфофилия цитоплазмы и пр.) были обнаружены у 48 пациенток (50 %). При расширенной кольпоскопии изменения, характерные для папилломавирусной инфекции, были выявлены и подтверждены гистологическим методом у 68 женщин (100 %), причём у 18 (31 %) обследуемых присутствовали признаки дисплазии слабой степени, а у двух (3%) – дисплазии умеренной степени. У всех обследованных был воспалительный тип мазка. При ВПЧ низкого онкогенного риска цитологические изменения при кольпоскопии не зарегистрированы.

В 45% случаев клиническим проявлением ВПЧ высокого онкогенного риска инфекции являлись остроконечные кондиломы (папилломы), представляющие собой бородавчатые разрастания на короткой ножке. Папилломы располагались в виде скоплений в 14% и в 31% в виде единичных образований. Чаще всего остроконечные кондиломы располагались в области входа во влагалище, на больших и малых половых губах, реже - на шейке матки, а также на промежности и вокруг заднепроходного отверстия. В 5% случаев проявлением ВПЧ инфекции высокого онкогенного риска являлись папиллярные кондиломы, которые представляли собой гладкие бородавки, располагающиеся в области входа во влагалище, на больших и малых половых губах у женщин, в параанальной области у мужчин.

Субклиническая форма ВПЧ-инфекции высокого онкогенного риска проявлялась в виде плоских кондилом в 14% сучаев. Плоские кондиломы располагались на шейке матки и реже - во влагалище в виде единичных (4%) или множественных разрастаний (10%). Субъективных жалоб пациенты с субклинической формой ВПЧ не предъявляли. При латентной форме ВПЧ-инфекции не имелось клинических проявлений. Анализ ранее проводимой терапии у обследуемых пациентов показал, что около 48% пациентам комплексной терапии не проводилось. Около 50% пациентов использовали иммуномодуляторы (препараты интерферонов, индукторы интерферонов).

Оценку содержания сывороточного растворимого Fas-рецептора (sFas), TRAIL и ФНО-α проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (см.ниже). Все пробы исследовались в динамике (в течение 30 дней): с момента поступления в стационар (или рецидива инфекции) и спустя месяц после проводимой комплексной терапии.

В группу контроля вошли 30 здоровых доноров, не имеющих антител к ВПГ-1, ВПГ-2 и ЦМВ в сыворотке крови и не содержащих ДНК ВПГ, ЦМВ и других инфекций, передающихся половым путем, в половом тракте.



4.2 Лабораторные методы исследования

Показатели апоптоза измерялись в следующих биологических материалах: сыворотка крови, уретральное и вагинальное отделяемое.



4.2.1 Метод определения sFAS

Для определения использовались 96 луночные тест-системы Bender MedSystems. Определение растворимого sFAS проводили по следующим образом:



  1. .Промывали ячейки планшета дважды Промывочным буфером.

  2. Добавляли по 100 мкл Разбавителя образцов в ячейки, предназначенные для Стандартов.

  3. Вносили по 100 мкл Разбавителя образцов в ячейки «Бланк».

  4. Вносили по 90 мкл Разбавителя образцов в ячейки, предназначенные для образцов.

  5. Вносили по 10 мкл каждого образца в дублях в соответствующие ячейки.

  6. Приготовили стандартные разведения добавлением 100 мкл разбавленного Стандарта sAPO-1/Fas в ячейки А1 и А2, создавая разведения стандарта sAPO-1/Fas в диапазоне от 1000 до 16 пг/мл переносом по 100 мкл из ячейки в ячейку. Удалили и выбросили 100 мкл жидкости из последних ячеек (G1, G2).

  7. Приготовили биотиновый конъюгат. Добавили по 50 мкл разбавленного биотинового конъюгата, готового для использования, во все ячейки, включая Бланк.

  8. Закрыли планшет плёнкой и инкубировали 1 час при температуре 37ºС.

  9. Приготовили стрептавидиновый конъюгат.

  10. Полностью удалили содержимое ячеек и промыли ячейки 4 раза Промывочным буфером.

  11. Вносили по 100 мкл стрептавидинового конъюгата во все ячейки. Закрыли планшет плёнкой и инкубировали 1 час при температуре 37ºС.

  12. Приготовили Субстратный раствор за несколько минут до использования. Полностью удалили содержимое ячеек и промыли ячейки 4 раза Промывочным буфером. Внесли по 100 мкл Субстратного раствора во все ячейки, включая Бланк. Инкубировали при комнатной температуре 15 минут (18°- 25°C). Добавили по 100 мкл стоп-раствора во все ячейки, включая Бланк. Определили оптическую плотность ячеек при 450 нм против «Бланка» при длине волны сравнения 610-650 нм.



4.2.2 Ход определения содержания TRAIL-связанного апоптоз

индуцирующего лиганда

А. Приготовление и разбавление стандартов

1. Восстанавливающий стандарт (3000 пкг/мл) соединить со стандартным разбавливающим буфером. Перемешать и оставить на 10 минут. Использовать не позже 1 часа после приготовления.

2. Добавить 300 мкл стандартного разбавляющего буфера в каждую из 6 ячеек, обозначенных 1500; 750; 375; 187,5; 93,7; 46,8 пкг/м TRAIL.

3. Сделать серийные разведения, как описано выше.

В. Разбавление и хранение стрептавидин-hrp

Нужно иметь ввиду, что 100 кратный стрептавидин-hpr разбавляется в 50% растворе глицерола и это вязкий раствор. Для того, чтобы сделать точные разбавления, довести раствор до комнатной температуры. Осторожно перемешать и пипетировать стрептавидин-hpr медленно. Убирать излишек раствора с помощью фльтровальной бумаги.


  1. Растворить 10 мкл 100 кратного стрептавидина-hpr в 1 мл растворителя стрептавидин-hpr для каждого стрипа. Отметьте рабочее разведение.

  2. Неиспользованный раствор хранить в холодильнике.

С. Разбавление промывающего буфера

Довести 25 кратный раствор до комнатной температуры и хорошо перемешать. Добавить к 1 объему 24 дистиллированной воды. Рабочий раствор можно хранить в холодильнике 14 дней.
ПРОВЕДЕНИЕ ПРОЦЕДУРЫ И ПОДСЧЕТ


  1. Сыворотку или плазму разбавляют 1-2 стандартным разбавляющим буфером

  2. Добавить 100 мкл стандартного разбавляющего буфера в нулевую ячейку

  3. Добавить 100 мкл стандартов или проб в соответствующие ячейки

  4. Накрыть и оставить в инкубаторе 2 часа при комнатной температуре

  5. отмыть 4 раза

  6. добавить 100 мкл биотинилированного анти TRAIL

  7. инкубировать 1 час при комнатной температуре

  8. промыть 4 раза

  9. добавить 100 мкл стрептавидин-hpr

  10. 30 минут инкубировать при комнатной температуре

  11. промыть 4 раза

  12. добавить 100 мкл стабилизирующего хромогена. Жидкость в ячейках начнет синеть

  13. 30 минут инкубировать при комнатной температуре в темном месте

  14. добавить 100 мкл стоп-раствора в каждую ячейку

  15. подсчитать оптическую плотность при длине волны 450 нм




1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   15

  • 4.2 Лабораторные методы исследования
  • 4.2.1 Метод определения sFAS
  • 4.2.2 Ход определения содержания TRAIL-связанного апоптоз