Методические указания к самостоятельной работе Красноярск сфу 201 2 ббк 28. 072 М 545

Главная страница
Контакты

    Главная страница


Методические указания к самостоятельной работе Красноярск сфу 201 2 ббк 28. 072 М 545



страница1/4
Дата31.03.2018
Размер0,6 Mb.


  1   2   3   4
Министерство образования и науки Российской Федерации

Сибирский федеральный университет




СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОХИМИИ
Методические указания к самостоятельной работе

Красноярск

СФУ

2012

УДК 577.1

ББК 28.072

М 545

Составитель О.А.Гусейнов

М 545 Спектральные методы исследования в биохимии: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост. О.А Гусейнов. – Красноярск: Сибирский федеральный университет, 2012. – 44 с.
В пособии представлены методические указания для самостоятельной работы студентов по следующим темам спектральных методов исследования: возможности современного спектрального анализа, принципы спектральных методов исследования, основные закономерности поглощения света, спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях, особенности проведения точной колориметрии, количественное определение ферментов, исследование флуоресценции, инфракрасная спектрофотометрия.

Предназначено для студентов специальности 020208.65 – «Биохимия».

Предложенные методические указания могут быть использованы преподавателями высшей школы при обучении студентов спектральным методам исследований в биохимии.


УДК 577.1

ББК 28.072

© Сибирский



федеральный университет, 2012

ВВЕДЕНИЕ

В курсе «Спектральные методы исследования в биохимии» изучаются теоретические и практические основы спектральных исследований с фокусом на последние достижения науки, современные методы исследования, использование современного лабораторного оборудования. Курс предназначен для студентов четвертого курса очной формы обучения направления 020200 – биология.

Главная цель дисциплины – ознакомление с важнейшими теоретическими принципами и методическими приемами спектральных методов исследования в биохимии. Предлагаемые методические указания для самостоятельной работы будут содействовать глубокому усвоению студентами учебного материала, формированию теоретических основ для проведения экспериментальных работ. Особое внимание обращается на проблему спектрального изучения соединений из живых организмов в индивидуальном виде.

Самостоятельная работа студентов по курсу «Спектральные методы исследования в биохимии» включает изучение теоретического материала: работу с научной, учебной, методической и справочной литературой, изучение лекционного материала; подготовку презентаций и написание реферата. В методических указаниях приведены вопросы для самостоятельной проработки теоретического материала и темы для написания реферата. Приводится список литературы, необходимой для самостоятельной подготовки.

Самостоятельная работа способствует развитию у студента таких навыков, как выбор и решение поставленной задачи, сбор и аналитическое изучение опубликованных результатов, умение выделить главное и сделать обоснованное заключение. Самостоятельная работа способствует развитию у студентов навыков творческого исследования, литературного редактирования.

В результате изучения дисциплины «Спектральные методы исследования в биохимии» обучающиеся должны



знать:

уметь:

  • работать с биологическим материалом;

  • оценивать и обрабатывать полученные экспериментальные результаты;

  • выбирать оптимальные методы достижения поставленных целей;

владеть:

  • приемами и навыками работы с современным спектральным оборудованием;

  • способами и технологиями защиты от вредных факторов профессиональной среды.

Систематическое усвоение программы практикума и лекционного курса обеспечивает фундаментальную теоретическую и практическую подготовку студентов, позволяющую им впоследствии самостоятельно работать в биохимических лабораториях самого различного профиля.

ПЕРЕЧЕНЬ ИЗУЧАЕМЫХ ТЕМ:


1. Спектральные исследования в биохимии. Возможности современного спектрального анализа.




2. Принципы спектральных методов исследования.




3. Основные закономерности поглощения света.




4. Спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях.




5. Особенности проведения точной колориметрии.




6. Количественное определение ферментов, кинетический анализ и разностная спектрофотометрия.




7. Исследование флуоресценции биологических объектов.




8. Инфракрасная спектрофотометрия.





ГРАФИК
самостоятельной работы студентов по дисциплине «Спектральные методы исследования в биохимии» специальности 020208.65 Биохимия Института фундаментальной биологии и биотехнологии 4 курса на 7 семестр


Недели учебного процесса семестра

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

ВЗ




ВЗ




ВЗ




ВЗ




ВЗ




ВЗ




ВЗ




ВЗ







ЗП




ЗП




ЗП




ЗП




ЗП




ЗП




ЗП




ЗП




ВРФ

ВРФ

ВРФ









































































ЗРФ

ЗРФ

ЗРФ





Условные обозначения: ВЗ – выдача темы для самостоятельного изучения; ЗП – защита презентации; РФ – реферат; ВРФ – выдача темы реферата; ЗРФ – защита реферата.

Тематический план занятий в часах.


п/п


Разделы дисциплины

Лекции

(часы)


ЛЗ

(часы)


Самостоя-тельная работа
(часы)

1

Раздел 1. Спектральные исследования в биохимии. Возможности современного спектрального анализа.

2

2

3,5

2

Раздел 2. Принципы спектральных методов исследования.


2

2

3,5

2

Раздел 3. Основные закономерности поглощения света.

2

2

3,5

3

Раздел 4. Спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях.

2

2

3,5

4

Раздел 5. Особенности проведения точной колориметрии.

2

2

3,5

5

Раздел 6. Количественное определение ферментов, кинетический анализ и разностная спектрофотометрия.



2

2

3,5

7

Раздел 7. Исследование флуоресценции биологических объектов.

2

2

3,5

8

Раздел 8. Инфракрасная спектрофотометрия.


2

2

3,5


ТЕМА 1.

Спектральные методы исследования в биохимии, возможности современного спектрального анализа.

Указания к изучению темы.

Спектральные методы исследования – это методы анализа веществ, основанные на изучении их оптических свойств. Главное преимущество спектральных методов состоит в том, что вещество в процессе исследования не разрушается. Методику исследований легко автоматизировать и модифицировать. Эти свойства спектральных методов делают их незаменимыми при исследовании биологических объектов. Спектральные методы позволяют обнаруживать крайне малые количества вещества в довольно сложных системах. Например, можно измерять количество восстановленных и окисленных компонентов дыхательной цепи в целых митохондриях. К спектральным методам исследования относятся: фотометрические методы, спектральный и люминесцентный анализы.

К фотометрическим методам относят спектрофотометрию и фотоколориметрию. Эти методы основаны на измерении поглощения света изучаемым веществом в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра. Фотометрические (абсорбционные) методы основаны па избирательном поглощении света исследуемым веществом и подчиняются закону Бугера — Ламберта — Бера (поглощение света пропорционально концентрации поглощающего вещества и толщине поглощающего слоя). При фотометрических методах анализ проводят по поглощению монохроматического света. Спектрофотометрия — один из наиболее точных фотометрических методов анализа, применяемых в биохимии. Ее используют для количественных определений (с большой точностью): белков, нуклеиновых кислот, витаминов, НАД, НАДФ, оксикортикостероидов в моче и плазме крови; при изучении активности многих ферментов. Фотоколориметрию используют при исследовании ферментов (кишечная щелочная фосфатаза, альдолаза и трансаминаза сыворотки крови, β-глюкуронидаза и прочие), глюкозы, аминокислот, белков, макроэлементов.

Спектральный анализ — качественный и количественный метод определения состава веществ, основанный на исследовании их спектров испускания, поглощения, отражения. Различают атомный и молекулярный спектральный анализ, задачи которых состоят в определении соответственно элементного и молекулярного состава вещества. Эмиссионный спектральный анализ проводят по спектрам испускания атомов, ионов или молекул, возбужденных различными способами, абсорбционный спектральный анализ – по спектрам поглощения электромагнитного излучения исследуемыми объектами. Качественный анализ производят по положению спектральных линий, количественный — по их интенсивности. В рутинных. исследованиях для изучения содержания ионов металлов и солей в жидкостях и тканях организма широко применяют спектрографы, регистрирующие спектры на фотоплёнке, а также атомные абсорбционные спектрофотометры. В биохимических исследованиях применяют и рентгеноспектральный анализ (по рентгеновским спектрам). В зависимости от цели исследования, свойств анализируемого вещества, специфики используемых спектров, области длин волн и других факторов хода анализа, аппаратура, способы измерения спектров и метрологические характеристики результатов сильно различаются. В соответствии с этим спектральный анализ подразделяют на ряд самостоятельных методов.



Люминесцентные методы анализа состава вещества основаны на люминесценции — свечении под воздействием облучения светом, электронами, в результате химических реакций. В зависимости от длительности свечения различают флюоресценцию и фосфоресценцию. Количественный анализ осуществляют на основе зависимости интенсивности флюоресцентного излучения от концентрации вещества. Флюоресцентное излучение,измеряемое специальными приборами — флюорометрами, используют для количественного определения витаминов B1, B2, фолиевой кислоты, гетероауксина, адреналина, стероидных гормонов, кодегидрогеназ, триптофана, антибиотиков , жёлчных кислот, жиров, порфиринов, а также некоторых лекарственных веществ. Флюоресцентные спектрофотометры позволяют исследовать аминокислоты, амины, витамины, стероиды, пуриновые и пиримидиновые основания и прочие метаболиты. Применяется также так называемый сортовой люминесцентный анализ, отделяющий внешне похожие разные объекты (например, нормальные клетки от опухолевых).

Литература к теме 1:

  1. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Общие вопросы спектроскопии. М.: Либроком, 2010.

  2. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Молекулярная спектроскопия. М.: Либроком, 2008.

  3. Беккер Ю. Спектроскопия. М.: Техносфера, 2009.

  4. Кудряшов Ю. Б., Перов Ю. Ф. Рубин А. Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения. Учебник для ВУЗов. — М.: ФИЗМАТЛИТ, 2008.

  5. Подавалова О.П., Лямкина Н.Э. Спектроскопия атомов и молекул. Красноярск: СФУ, 2007. Электронный ресурс.

  6. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов: учебник. М. Дрофа. 2006.

  7. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.

  8. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.

  9. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.

Вопросы для самоконтроля.

1. Какое место методах биохимических исследований занимают спектральные методы?

2. В чем состоят преимущества спектральных методов исследований в биохимии?

3. Перечислите основные спектральные методы исследования в биохимии.

4. Опишите принципы фотометрических методов, применяемых в биохимии.

5. Какие биохимические исследования можно проводить, используя фотометрические методы?

6. Опишите принципы методов спектрального анализа, применяемых в биохимии.

7. Какие биохимические исследования можно проводить, используя методы спектрального анализа?

8. Опишите принципы люминесцентных методов анализа, применяемых в биохимии.

9. Какие биохимические исследования можно проводить, используя методы люминесцентного анализа?
ТЕМА 2.

Принципы спектральных методов исследования.

Указания к изучению темы.

Видимый свет, тепловое и ультрафиолетовое излучение, рентгеновские и гамма лучи, а также радиоволны представляют собой электромагнитные волны, распространяющиеся со скоростью 3.10м.с- 1. Для понимания механизмов, лежащих в основе спектральных свойств атомов и молекул, используем квантовую теорию электромагнитного излучения. Согласно квантовой механике, свет – это поток частиц, которые называются квантами или фотонами. Энергия каждого кванта определяется длиной волны излучения.

В основном энергетическом состоянии электроны в атоме занимают самые нижние энергетические уровни, располагаясь на них в соответствии с законами квантовой механики. При поглощении кванта электрон переходит с нижнего уровня на более высокий, переходя в возбужденное состояние. При этом энергия кванта должна точно соответствовать разности энергетических уровней. Когда электрон переходит обратно из возбужденного состояния в основное, происходит испускание кванта, иначе говоря, излучение света определенной длины волны.

При образовании молекул электроны атомов занимают новые положения, появляются новые энергетические уровни. Атомы в молекуле могут колебаться и вращаться вокруг связей, это приводит к возникновению около электронных уровней молекулы колебательных и вращательных подуровней. Каждый электрон в молекуле, также как в атоме, занимает самый нижний энергетический уровень, при этом молекула находится в основном состоянии. При поглощении кванта энергии электрон переходит на более высокий энергетический уровень, то есть переходит в возбужденное состояние. Поскольку в молекулах каждое основное и возбужденное состояния разбивается на ряд энергетических подуровней, спектры молекул являются обычно полосатыми. А вот спектры атомов являются довольно простыми, линейчатыми, так как в атомах отсутствуют колебательные спектры.

Как и в атомах, в молекулах переход электрона с одного уровня на другой сопровождается поглощением или испусканием кванта энергии. В таких случаях поглощенную или излучаемую энергию можно определить по формуле:

Е = Е1 – Е2 = hν ,

где Е – поглощенная или излучаемая энергия, Е1первоначальная энергия электрона, Е2 – конечная энергия электрона, h – постоянная Планка, равная 6,63×10 – 34 Дж.с, νчастота колебаний в герцах.

Длина волны излучения или поглощения связана с частотой электромагнитного излучения по формуле:

ν = С : λ,

где С – скорость света, равная 3.10м.с- 1, λ – длина волны.

Длина волны обычно измеряют в микрометрах, сантиметрах, нанометрах или ангстремах. Спектр электромагнитного излучения представляет собой зависимость количества поглощенной или излученной объектом энергии от длины волны. Молекулы взаимодействуют с излучением в широком диапазоне длин волн, поэтому их спектры лежат в разных областях. Для измерений в каждом спектральном диапазоне используют специальное оборудование. Некоторые типы спектров снимать относительно легко, поэтому соответствующие методы широко используются биохимиками в повседневной работе. Существуют, однако, области спектроскопии, где необходимо применять довольно сложное оборудование. Такие методы используются лишь для детального исследования биологических макромолекул и других клеточных структур.

Электронные спектры которые обусловлены переходом электронов наружных электронных оболочек атомов с одного энергетического уровня на другой, занимают видимую и ультрафиолетовую область электромагнитного излучения. Обычно электронные переходы сопровождаются изменениями на колебательных и вращательных уровнях. Данная область спектроскопии широко применяется в биохимии.

Колебательно-вращательные спектры обусловлены изменением энергии колебательных подуровней. Такие изменения, как правило, осуществляются в ближней инфракрасной области. Инфракрасная спектроскопия часто используется для изучения структуры биологических макромолекул в неводных средах. Вращательные спектры располагаются в далекой инфракрасной и микроволновой областях. В биохимии они используются редко. Спектры комбинационного рассеяния света (рамановские спектры) обусловлены изменением колебательных и вращательных подуровней одновременно. Такие переходы происходят в близкой инфракрасной области. Рамановская спектроскопия дополняет информацию, полученную с помощью вращательных и колебательных спектров. В биохимии рамановская спектроскопия применяется довольно редко.

Спектры электронного парамагнитного резонанса и ядерного магнитного резонанса обусловлены изменениями направления спинов соответственно электронов и ядер в магнитном поле. Эти методы широко применяются при изучении структуры биологических макромолекул.



Литература к теме 2:

  1. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Общие вопросы спектроскопии. М.: Либроком, 2010.

  2. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. Молекулярная спектроскопия. М.: Либроком, 2008.

  3. Беккер Ю. Спектроскопия. М.: Техносфера, 2009.

  4. Кудряшов Ю. Б., Перов Ю. Ф. Рубин А. Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения. Учебник для ВУЗов. — М.: ФИЗМАТЛИТ, 2008.

  5. Подавалова О.П., Лямкина Н.Э. Спектроскопия атомов и молекул. Красноярск: СФУ, 2007. Электронный ресурс.

  6. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. М.:Издательство МГУ. 2007.

  7. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Квантовая механика (нерелятивистская теория). — Издание 6-е, исправленное. — М.: Физматлит, 2004.

  8. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.

  9. Коэн-Таннуджи К., Диу Б., Лалоэ Ф. Квантовая механика. Т.1. Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2000.

  10. Коэн-Таннуджи К., Диу Б., Лалоэ Ф. Квантовая механика. Т.2. Екатеринбург: Изд-во Уральского ун-та, 2000.

  11. Banwell C.N., McCash Fundamentals of molecular spectoroscopy. McGraw-Hill Book (Europe), York 1995.

  12. Уильям Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.

Вопросы для самоконтроля.

  1. Какую теорию используют для понимания механизмов, лежащих в основе спектральных свойств атомов и молекул?

  2. Какие процессы в атомах и молекулах происходят при поглощении и излучении квантов?

  3. В чем состоит принципиальное видимое отличие атомных и молекулярных спектров?

  4. Как связаны между собой энергия излучаемого света и длина волны излучаемого (поглощаемого) света?

  5. Что называется спектром электромагнитного излучения?

  6. Какие виды спектров получать относительно легко?

  7. Для получения каких видов спектров требуется довольно сложное оборудование?

  8. Охарактеризуйте виды спектров, применяемых в биохимии.

  9. Какие методы широко применяются при изучении структуры биологических макромолекул?

  1   2   3   4

  • Составитель О.А.Гусейнов М 545
  • Тематический план занятий в часах.
  • ТЕМА 1. Спектральные методы исследования в биохимии, возможности современного спектрального анализа
  • Вопросы для самоконтроля. 1. Какое место методах биохимических исследований занимают спектральные методы
  • 4. Опишите принципы фотометрических методов, применяемых в биохимии. 5. Какие биохимические исследования можно проводить, используя фотометрические методы
  • 6. Опишите принципы методов спектрального анализа, применяемых в биохимии. 7. Какие биохимические исследования можно проводить, используя методы спектрального анализа
  • 8. Опишите принципы люминесцентных методов анализа , применяемых в биохимии.
  • Указания к изучению темы.
  • Е = Е
  • Вопросы для самоконтроля. Какую теорию используют для понимания механизмов, лежащих в основе спектральных свойств атомов и молекул
  • Какие процессы в атомах и молекулах происходят при поглощении и излучении квантов В чем состоит принципиальное видимое отличие атомных и молекулярных спектров
  • Как связаны между собой энергия излучаемого света и длина волны излучаемого (поглощаемого) света Что называется спектром электромагнитного излучения
  • Какие виды спектров получать относительно легко Для получения каких видов спектров требуется довольно сложное оборудование